Een nieuwe snelle ’glow-in-the-dark’ test voor infectieziekten

- EN- NL
Foto: Harm van der Veer.
Foto: Harm van der Veer.
Onder anderen Harm van der Veer en Maarten Merkx hebben een nieuwe op bioluminescentie gebaseerde sensor ontwikkeld waarmee minieme hoeveelheden viraal of bacterieel DNA/RNA in monsters van patiŽnten kunnen worden opgespoord.

PCR-tests - de zeer gevoelige gouden standaard voor het opsporen van het COVID-19 virus - vereisen dure apparatuur, deskundige technici en speciale laboratoriumfaciliteiten, wat leidt tot testtijden van enkele uren of zelfs een dag. Onderzoekers van de Technische Universiteit Eindhoven, het Rijnstate Ziekenhuis en Fontys Hogescholen hebben een nieuwe test ontwikkeld op basis van een ’glow-in-the-dark’ benadering waarmee DNA/RNA van virussen en bacteriŽn rechtstreeks kan worden gedetecteerd met dezelfde gevoeligheid als een PCR-test, en dat alles in slechts 30 minuten.

"PCR-testen zijn zeer nauwkeurig en waren van onschatbare waarde tijdens de pandemie", zegt Maarten Merkx, van het Institute for Complex Molecular Systems (ICMS), faculteit Biomedical Engineering, en hoofd van het Merkx Lab aan de TU/e. "Maar het kan enkele uren, en vaak een dag, duren om de uitslag van een PCR-test te krijgen."

Een deel van de tijdsvertraging bij PCR-testen, die controleren op de aanwezigheid van viraal DNA of RNA in een patiŽntenmonster, is de noodzaak van een thermisch cyclisch proces.

"Via PCR geteste monsters kunnen minuscule hoeveelheden viraal DNA/RNA bevatten. Om dit detecteerbaar te maken, wordt het monster onderworpen aan cycli van verhitting en afkoeling. Dit leidt tot de juiste omstandigheden voor DNA/RNA replicatie", zegt Harm van der Veer, die promovendus is in het Merkx Lab aan de TU/e. "Maar er is dure apparatuur voor nodig, waardoor het niet geschikt is voor gebruik door huisartsen of andere lokale gezondheidsinstellingen, laat staan als thuistest."

Enter LUNAS

Om deze nadelen aan te pakken hebben Van der Veer, Merkx en collega’s van de TU/e, Rijnstate Ziekenhuis en Fontys Hogeschool een nieuwe sensor ontwikkeld die bij de huisarts gebruikt kan worden, snelle resultaten geeft en een vergelijkbare gevoeligheid en specificiteit heeft als de PCR-test.

En net als de PCR-test heeft hun test een pakkende afkorting. Hij heet LUNAS. Hun werk aan de test is zojuist gepubliceerd in het tijdschrift ACS Central Science. Van der Veer: "LUNAS staat voor luminescent nucleic acid sensor, wat betekent dat we een bioluminescente sensor hebben gemaakt om de nucleÔnezuren (de moleculen waaruit DNA of RNA bestaat) te detecteren die in virussen en bacteriŽn voorkomen."

Het Merkx Lab heeft veel ervaring met bioluminescente sensoren. "Veel organismen zoals vuurvliegjes gebruiken bioluminescentie om licht te produceren. In onze sensoren combineren we eiwitten die een bepaald biomolecuul binden (zoals een antilichaam of DNA of RNA) met zogenaamde luciferase-enzymen, die licht uitzenden bij detectie van het doelbiomolecuul in een monster", zegt Merkx.


Bovendien hebben bioluminescente sensoren geen externe excitatie nodig en kan de ’glow-in-the-dark’-respons worden gedetecteerd met een gewone digitale camera die je in een smartphone vindt.

Een CRISPR helpende hand

Bij de ontwikkeling van LUNAS stuitten de onderzoekers op twee grote uitdagingen: ’Hoe kan de test de thermische cyclische amplificatie van DNA nabootsen die bij PCR-tests wordt gebruikt?’ en ’Hoe kan de sensor zich nauwkeurig en snel aan het resulterende DNA binden?’.

"Ons doel was een test met de gevoeligheid om een enkel stukje DNA te detecteren in een microliter monster (een monster van ťťn miljoenste liter) dat ook nog veel andere moleculen bevat. Het is alsof je probeert ťťn specifieke, kleine vis te vinden in een zee van een biljard (1015) liter water vol met heel veel andere vissen", zegt Van der Veer.

Om snel meer virale DNA/RNA-kopieŽn in een monster te produceren, gebruikten de onderzoekers ten eerste de zogenaamde recombinase polymerase amplification (RPA), die ideaal is voor gebruik in point-of-care (dicht bij de patiŽnt) tests vanwege de werking bij lage constante temperatuur.

Ten tweede, om te zorgen voor specifieke detectie van het DNA/RNA in het monster riepen de onderzoekers de hulp in van CRISPR. "De meeste mensen associŽren CRISPR met genetische modificatie, maar de kern van CRISPR is een zeer nauwkeurige manier om stukjes DNA te herkennen en te binden", zegt Van der Veer.

Dus bonden de onderzoekers twee CRISPR-eiwitten aan een gesplitst bioluminescent eiwit (Zie afbeelding). Deze eiwitten zijn ontworpen om stukjes viraal DNA te herkennen en te grijpen. Als ze dat doen, worden de twee stukken van het bioluminescentie-eiwit samengevoegd en produceren ze blauw licht. Vervolgens kunnen de onderzoekers het blauwe licht detecteren met een digitale camera.

Als er geen viraal DNA/RNA in het monster zit, zendt de sensor weinig of geen blauw licht uit. In plaats daarvan zendt een referentie bioluminescent eiwit alleen groen licht uit.

"Als er wel viraal DNA/RNA aanwezig is, is er binnen ongeveer 10 - 30 minuten een duidelijke toename van de verhouding tussen blauw en groen licht. Het is als een moleculair verkeerslicht", voegt Merkx toe. Om de nauwkeurigheid van de LUNAS-sensor voor het opsporen van virusinfecties te valideren, testten de onderzoekers COVID-19-patiŽntmonsters die door het Rijnstate Ziekenhuis ter beschikking waren gesteld.


iGEM wortels en toekomst plannen

LUNAS is helemaal terug te voeren tot het iGEM Eindhoven 2019 studentenproject, toen Van der Veer deel uitmaakte van het studententeam dat werkte aan het maken van een test voor de snelle detectie van bacteriŽle pathogenen en het helpen bestrijden van antimicrobiŽle resistentie.

Vanuit het werken aan dat project ontwikkelde Van der Veer zijn interesse in biosensoren, wat leidde tot zijn masteronderzoek, en nu promotieonderzoek, bij het Merkx Lab. "De LUNAS test is echt een vrucht van het iGEM project van toen", zegt van der Veer.

LUNAS lijkt ook ontwikkeld te gaan worden om andere ziektes op te sporen. "In een samenwerking met Fontys, bedrijven en zorgverleners, en onder leiding van TU/e-promovendus Yosta de Stigter, ontwikkelen we LUNAS om te testen op seksueel overdraagbare aandoeningen (SOA’s) en werken we aan een draagbaar microfluÔdisch apparaat om te helpen bij het gebruik ervan op point-of-care (dicht bij de patiŽnt) locaties", zegt Merkx.

Van der Veer en Merkx denken ook aan commercialisering, met name in de gezondheidszorg. Er zijn echter belangrijke barriŤres voor de adaptatie in de gezondheidszorg.

"Op dit moment missen we een eenvoudig en draagbaar apparaat voor de test, dat het gebruik bij huisartsen of zelfs thuis makkelijker zou maken", merkt Van der Veer op. "Daarnaast zou het geweldig zijn om een commerciŽle partner te hebben die de tests op grote schaal kan produceren, waarbij ook rekening wordt gehouden met alle wettelijke stappen die bij het maken van een dergelijke test in acht moeten worden genomen."

Aanvullende informatie

Dit onderzoek is ondersteund door het Covid-19 oeuf fonds. Het onderzoek in dit project wordt ook ondersteund door de Nederlandse Onderzoeksraad (NWO) Nationaal Regieorgaan Praktijkgericht Onderzoek SIA (NRPO-SIA) project RAAK.PRO02.066.

Paper titel: Glow-in-the-Dark Infectious Disease Diagnostics Using CRISPR-Cas9-Based Split Luciferase Complementation , ACS Central Science, (2023).